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优化瞬转方案,一键提升转染效率!

浏览数量: 0     作者: 本站编辑     发布时间: 2024-03-22      来源: 本站

瞬时转染工艺是将外源性重组DNA导入真核细胞内以获得目的基因高水平表达的一种专门技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展,瞬时转染目前已成为创新药物研发早期研究候选药物的药效、作用机制、毒理学反应、药代特点及药物相互作用的基本方法。

一. 瞬时转染技术

瞬时转染方法是指将构建好的质粒通过化学、生物、物理方法导入到哺乳动物细胞内,导入的外源基因不会整合到宿主细胞基因组中,只会短暂地存在于宿主细胞的细胞核与细胞质中,导入的高拷贝数外源基因在转染后发生转录翻译,得到所需的目的蛋白。相比于稳定转染,瞬时转染具有快速、灵活、高效的优势,能满足重组蛋白生产周期短、表达量大的需求。CHO(中国仓鼠卵巢细胞)作为常用的重组蛋白表达细胞株,常被用做进行瞬时转染操作的载体。

二. 转染重要参数

01 细胞状态

细胞密度:通常情况下,CHO-S细胞在对数生长期中期进行转染,更有助于质粒DNA在细胞核内进行重组蛋白表达。

细胞活率:细胞表征健康最直接的指标是细胞活率,在进行细胞转染实验之前,应确保细胞活力高于90-95%以上。

细胞代次: 在转染过程中,细胞的传代次数会影响转染效率和基因表达水平。一般来说,高传代细胞相对于低传代细胞,在转染效率和表达水平上可能会有下降。这是因为细胞在传代过程中会经历一系列的分裂和复制,这可能导致基因组的不稳定性增加,细胞脱离周期调控,染色体异常等。通常可以通过评估细胞内核苷酸比率等指标来判断细胞是否处于老化状态,从而选择合适代次的细胞进行转染实验。

总之,转染细胞密度、细胞活力和种子代次都是影响瞬时转染的重要参数,需要综合考虑它们的影响并加强对其分子机理的研究,以实现高产量和可重复性的转染实验。

02 质粒DNA

化学转染方法是目前最常用的转染方法,通过带正电荷的阳离子物质(PEI)和带负电荷的核酸(质粒DNA)通过静电作用形成转染复合物,经细胞的内吞作用进入细胞。

对于瞬时转染来说,质粒DNA的是最主要的影响因素之一。质粒的主要质量参数包括A260/A280比值(1.8~2.0)和超螺旋质粒百分比(70-90%)。A260/A280比值是衡量DNA纯度的常用指标,合理的比值范围表明DNA中没有明显的蛋白质污染。超螺旋质粒百分比表示质粒DNA的超螺旋化程度,高比例的超螺旋质粒有助于提高质粒的稳定性和转染效率。

如果质粒DNA 的纯度不高,存在杂质,如盐离子、蛋白、代谢物等都会显著影响转染复合物的形成,进而影响转染效率。如果出现这种情况,应对质粒DNA进行纯化和浓缩后使用。

03 转染试剂

目前市面上使用较多的化学转染试剂主要是阳离子脂质体Liposome和阳离子聚合物PEI。

Liposome因其可携带大片段DNA,通用于各种类型的DNA和RNA,在体外基因转染中高效等特点,应用领域非常广泛。但脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的失调,造成细胞毒性,对测试结果造成严重干扰。

PEI是一种阳离子聚合物,可以通过静电作用缩合DNA分子,形成具有净正电荷的纳米复合物(多链体)。PEI常用的类型是线性PEI(LPEI)和支链PEI(BPEI),相对分子量(MW)范围在1~1600kDa。PEI的转染效率和细胞毒性主要受到分子量、支链化程度和阳离子电荷密度的影响。随着分子量的增加,转染效率逐渐提高,但与此同时细胞毒性也显著增加。与支链PEI分子相比,线性PEI分子具有较低的细胞毒性,并且具有更强的DNA压缩能力,这增加了形成复合物的平均粒径,从而增加了细胞与复合物接触的机会,最终提高了转染效率。

PEI是重组蛋白或病毒生产中应用最广泛的转染试剂,尤其是大规模应用领域,同时成本低,转染效率和表达水平高,目前已经成为瞬转领域的黄金标准。

04 瞬转工艺参数

常用的瞬转工艺的参数,一般是指DNA 用量,PEI 与DNA 的比例,DNA 与PEI 混合后的孵育时间以及转染时间(复合物与细胞接触时间)。

DNA浓度的不同最终会影响转染后单个细胞获得的外源质粒拷贝数,进而影响蛋白表达。

DNA与PEI的比例会极大地影响复合物的粒径、结构和表面电荷等特性。适当的DNA与PEI比例可以促进复合物的形成和细胞摄取,从而提高转染效率。通常,推荐的DNA与PEI质量比为1:1到1:6之间,但最佳比例仍然需要根据具体实验进行优化。

孵育时间会影响DNA 分子与PEI分子结合和相互作用。适当的孵育时间有助于复合物的形成和成熟过程,通常在5分钟到20分钟之间。在孵育期间,可以通过适当的混合和轻轻摇动来促进DNA与PEI的相互作用。

转染时间的不同影响细胞与外源DNA/PEI 复合物的接触时间,也会影响细胞吞噬的外源基因数量。

为了获得高转染效率和蛋白表达量,需要仔细考虑和优化这些转染条件。通过一系列的实验和参数优化,以确定最佳的转染参数,满足特定实验的需求。

05 瞬转培养基配方

培养基是瞬时转染的最基本要素。细胞生长状态良好的培养基通常会包含一些化合物,如血清、生长因子、多肽等,如血清中大量带负电的蛋白质会干扰阳离子脂质体对核酸的吸附,极大的影响转染效率。

另一方面,适合瞬时转染的培养基通常会包含一些成分,可以促进细胞聚集和形成多细胞团块。这种聚集状态对于瞬时转染是有利的,因为细胞聚集可以提高复合物与细胞的接触和摄取,从而增加转染效率。然而,与单细胞形式生长的培养基相比,细胞聚集状态下的培养基往往不支持高细胞密度的维持。这是因为细胞聚集会导致细胞之间的竞争性生长和营养限制,从而限制了细胞数的增加。因此,在进行瞬时转染时,可能需要在细胞密度较低的情况下进行转染,以确保足够的细胞与复合物接触。

因此,培养基的组成对于细胞的生长状态和瞬时转染效率有着密切的关系。为了获得高转染效率和细胞密度的维持,可能需要在培养基配方中进行一些调整和优化,以平衡细胞生长和转染效率之间的关系。

三. Eminence-CHO瞬时转染平台

借助深厚的CHO细胞培养基配方开发经验,艾米能斯成功针对ExpiCHO-S细胞开发出一套包含培养基和工艺参数的高效瞬时转染解决方案。保证卓越的转染效率的同时,在维持细胞活力和高细胞密度方面也取得突破。通过精确控制DNA用量、复合物形成时间、转染时间等关键因素,我们的工艺能够实现高效的外源基因导入和稳定的蛋白表达。Eminence-CHO瞬时转染平台,拥有完善的实验条件及自主研发的培养基,能够实现高效率,高表达,能显著提高您的转染效率和实验效果。以下是该平台的主要优势:

  • 直接使用,无需驯化,尤其适合ExpiCHO-S瞬转表达

  • 倍增时间约为17h,且细胞大小均一,无结团情况

  • 对应产品:EmCD CHO-S 203瞬转培养基及补料

P20300-EmCD CHO-S 203培养基-Powder   L20310-EmACF CHO 203补料培养基new-Liquid

四. 细胞瞬时转染步骤(以EmCD CHO-S 203 系列为例

Tips:转染前细胞应完全适应EmCD CHO-S 203培养基,并以常规密度进行传代。

第1步:准备

1. 细胞准备

a) 转染前一天,将细胞密度调整为2.2 -2.5 x 106 /mL,使用培养基:EmCD CHO-S 203培养基+6mM谷氨酰胺。

第2步:转染

1. 细胞密度确认

a) 转染当天用新鲜的EmCD CHO-S 203培养基+6mM谷氨酰胺调整细胞密度至5.5-6.0 x 106 /mL,125mL摇瓶中准备细胞液28mL。

2. 转染试剂准备

a) 将质粒DNA放置室温5min以上。

b) 按照表1准备转染复合物(以30mL转染体系为例)

转染复合物

复合物 A (1ml)

EmCD CHO-S 203培养基

1mL

DNA

30ug

复合物 B(1ml)

EmCD CHO-S 203培养基

1mL

聚乙烯亚胺(PEI,Polysciences, 货号:24765)

90μg

备注:复合物A/B在进行最终混合前,需要在室温静置5min。

表1  30mL转染体系的推荐配制方法

3. 将复合物B添加至复合物A中(总体积2mL),利用漩涡混悬或轻柔吹打2-3次的方式进行混合。

4. 经混合物室温放置5分钟进行孵育。

5. 将混合物慢慢添加至准备的细胞中(步骤2,28mL),在添加的过程中,轻柔的震荡细胞进行混匀。

6. 将细胞置于摇床中培养:37℃, 5% CO2, 100rpm±5(轴距50mm)。

第3步:添加补充剂及补料

1.转染后直接补加表2中的补充剂,添加过程中,轻柔震荡摇瓶进行混合。

名称

添加量(初始体积%)

以30mL体系为例

EmCD HEK293 Plus 补充剂1

0.5%

0.15mL

表2 推荐添加物加入方法


2. 转染Day1-10天,补加表3中的补料。

名称

添加量(初始体积%)

以30mL体系为例

补料时间点

EmACF CHO 203补料培养基

8%

2.4mL

D1&D5

表3 推荐补料加入方法

3. 转染后第1天降温至32℃。

4. 培养过程中维持葡萄糖浓度在2g/L以上。

第4步:蛋白收获

1. 转染后7-10天,大部分的蛋白表达产量会达到最高值。培养结束时间点可以根据客户原工艺进行调整。

2. 培养工艺优化有助于提升蛋白产量。

期待您与艾米能斯合作,体验先进的CHO细胞瞬时转染平台,以及优化的基础培养基和补料培养基!您可以通过以下方式与我们联系:

1.请联系您的区域销售代表

2.请致电Eminence客服电话: 18912730685

3.请将需求邮件发送至邮箱vip@eminencebio.com或点击“阅读全文”在线申请


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