埃美益高性能灌流培养基，助力灌流工艺开发和优化

近30年来，生物制药行业迅速发展。从1990年的约44亿美元增长到2017年的超过1800亿美元。预计到2025年，全球生物制药市场将达到近5000亿美元。目前重组蛋白、疫苗及单克隆抗体等生物药的生产主要依靠哺乳动物细胞的表达系统，随着生物药的市场需求越来越多，哺乳动物细胞培养工艺的开发和优化也成为研究的热点。其中连续生产（Continuous Production）因其具有更高效、灵活等优势，已经逐渐成为生物药物未来的技术趋势。早在2011年，FDA就鼓励传统批量生产企业向连续生产转变。2019年2月，FDA发布声明推进连续生产，并在申明中强调“连续生产是提高药品质量和效率的关键一步”，此外，FDA还颁布连续生产的质量考虑指南草案，尽管端到端的药物连续生产仍有待完善，但连续生产无疑将成为制药行业未来发展的重要方向。

01 细胞培养灌流工艺

细胞培养灌流工艺(Perfusion Culture)是生物连续生产工艺的重要组成部分。在灌流培养模式中，通过细胞截留装置，反应器内营养耗竭的培养基被连续置换为新鲜的培养基，同时细胞被截留在反应器罐内。与传统批培养（Batch）或流加培养（Fed-Batch）模式相比，灌流培养工艺可使用更小的设备，获得与大规模设备相当或更高的产量，在一定程度上节约了成本，并增加了操作的灵活性。基于灌流技术的连续工艺因其在重组蛋白质、多特异性抗体等易降解、难表达的分子的开发方面的优势而受到行业的日益关注。目前，超过20个商业化产品采用了灌流工艺进行生产。

02 细胞培养灌流工艺优化方向

1.灌流培养细胞截留装置

细胞截留是悬浮细胞灌流培养的主要工艺要素之一，其核心挑战在于如何在截留过程中有效保护细胞免受损害。细胞的截留装置主要采用过滤、沉降、离心等原理设计。在大规模灌流培养主流的是基于中控纤维切向流过滤原理开发的细胞截留装置成为主流，其优点在于可以实现100%的细胞分离以及线性化规模放大。这一类型的细胞截留装置主要有两种，切向流过滤( tangential flow filtration，TFF) 和交替切向流过滤( alternative tangential filtration，ATF) 。

切向流过滤（TFF）中，细胞液通过蠕动泵作用形成一个连续的环形流动方向，进入纤维膜后，废液会通过膜排出体系之外，细胞会随着环路重新回到培养体系之内。TFF切相流技术则通过蠕动泵货其它增压方式改变过滤方向使其与液体流向相互垂直，从而减少过滤器堵塞风险。但TFF切向流方式会产生较大的细胞剪切力而增加细胞裂解的风险。交替切向流（ATF）是将中空纤维柱、高压空气泵、隔膜真空泵相互连接，通过气泵与真空泵调节压力差，使细胞和培养基通过中空纤维柱反复交替，从而达到细胞截留在中空纤维柱内的培养的方法。相比于传统的TFF，ATF采用了隔膜泵代替了蠕动泵，从而减少了对细胞的剪切力，同时隔膜泵的周期性凹凸运动导致培养液在中空纤维柱中产生交替的往复流动，这种反向冲刷作用在一定程度上减缓了柱子堵塞的速度。ATF不仅可以实现高细胞密度的维持，还能提高产物的产量和质量，因此在灌流培养工艺中更受青睐。

2.灌流过程中工艺参数控制

• 细胞比灌流速率(Cell specific perfusion rate，CSPR)

CSPR是其中关键的工艺参数，其通常定义为单位细胞单位时间内灌流到的新鲜培养基体积，相应的计算公式为：

CSPR=PR/VCD×1000 公式中，CSPR：细胞比灌流速率(pL/(cell·d))；PR：perfusion rate，灌流速率(vvd, L/(L·d))；VCD：viable cell density，活细胞密度(106 cells/mL)。

CSPR反映了灌流提供给细胞的营养水平，并不代表细胞自身的代谢状态。在灌流培养工艺的开发和优化中，CSPR作为连接PR和VCD的桥梁，具有重要的指导价值。降低CSPR值是工艺设计的一个重要因素，其带来的显著受益在于降低生产成本和提高产物质量和浓度。

• 放流速率(Bleeding rate)

在灌流培养过程中，当达到特定的细胞密度，可通过放流取出一部分含有细胞的培养液，使反应器内维持恒定的工作体积和细胞密度，同时避免了因死细胞裂解产生的细胞碎片和释放的核酸及蛋白质等物质导致的细胞截留装置膜孔堵塞的情况。

在灌流培养工艺的稳定阶段，我们需要在维持足够高的细胞密度以确保较高的目的产物时空产率的同时(Space-time yield，STY，g/(L·d))，朝着降低放流速率的方向进行优化，以进一步提高产物收率。

降低放流速率的基本原则是通过营养限制或环境限制为细胞提供次优的生长条件，以降低细胞的生长速率。通常，通过将细胞停滞在G0/G1期（细胞周期的准备期），可以实现细胞分裂的滞留。在这个阶段，细胞的代谢活性较高，包括目的产物的合成。

• 细胞比生产速率(Cell specific production rate，Qp)

Qp其通常定义为单位细胞单位时间内抗体蛋白的产量，代表的是细胞异源表达重组蛋白的能力，它是细胞系构建过程中初筛、复筛的主要技术指标，其相应的计算公式为：

Qp=总Titer/IVCD 公式中，Qp：细胞比生产速率（pg/cell/day），总Titer=收获液中累积Titer+细胞废弃中titer+反应器内titer（g/L），IVCD：integral of viable cell density，活细胞密度积分，即活细胞密度对时间的积分。

活细胞密度、Qp、培养周期（取决于高细胞密度下的细胞活力维持）常常是影响时空产率的关键因素。从细胞株的角度来看，可以通过细胞构建和克隆筛选来获得生长优异、代谢优良、产量可观的细胞株作为生产用细胞株。从细胞培养工艺的角度来看，可以采取多种策略来优化培养基和控制参数，以提高时空产率。首先，根据具体的细胞株特性和目标产物类型，优化培养基配方（包括营养物质的浓度和比例），以满足细胞的生长和产物合成的需求。其次，在培养过程中，对各种参数进行精确控制和调节也是至关重要的。例如，温度、溶氧和pH等环境因素可以对细胞的生长和代谢活性产生重要影响。通过优化这些参数的控制策略，可以为细胞提供最适宜的生长环境，促进其生长和产物合成。

3.灌流培养基配方开发

在整个灌流培养工艺的开发和优化过程中，灌流培养基的设计与优化起到决定性作用。由于灌流过程中需要连续供应培养基，培养基的配方和性能直接影响到细胞的生长和产物的合成。在流加工艺占据主导的今天，市面上仍缺乏灌流专用的平台培养基。生物制药企业在探索灌流工艺时，往往只能使用基础培养基与少量补料培养基混合来作为灌流培养基使用，这些培养基没有经过专门的灌流配方优化，往往不能发挥灌流培养基的全部潜力。例如，在流加工艺中，刺激细胞生长的培养基成分是必不可少的，但在灌流工艺的生产阶段，可能不需要，甚至是有害的。因此灌流培养基的开发也必须基于对培养基成分的分析，一种常用的方法是通过MVA分析定向找出关键组分，再利用设计实验DOE的方法对快速优化关键组分浓度，从而提升培养基的性能。目前市面上对于灌流培养基，不仅要求能支持以较低的细胞特异性灌流速率（CSPR）进行培养来减少培养基的消耗，而且还要最大化细胞培养的时间和蛋白产率。为了实现上述目标，需要通过灌流培养基配方的优化来进行操作。

03 EmCD CHO^® 906灌流培养基

借助丰富的CHO细胞培养基配方开发经验，埃美益隆重推出自主研发的EmCD CHO^® 906灌流培养基。EmCD CHO^® 906灌流培养基可以支持CHO细胞在灌注培养工艺下高密度生长和表达。稳定的批间质量，快速灵活的货期，专业的售后服务为客户的稳定生产保驾护航。EmCD CHO^® 906灌流培养基化学成分完全限定，不含动物源成分，确保了细胞培养过程的安全性和稳定性。

04 EmCD CHO^® 906 灌流培养数据分享

埃美益自主开发的EmCD CHO^® 906灌流培养基是一款高性能CD（Chemical Defined）培养基，可用于CHO-K1细胞高密度灌流培养。CHO-K1细胞可维持50-60*10⁶cells/mL的密度长时间稳定生长和表达，且产品关键质量SEC和CEX在细胞生长过程中保持稳定。

（图1）CHO-K1 细胞EmCD CHO^® 906 灌流培养基中的生长

（图2）CHO-K1 细胞EmCD CHO^® 906 灌流培养基中的乳酸代谢

（图3）CHO-K1 细胞EmCD CHO® 906 灌流培养基中的抗体表达量

Sample Name	SEC			CEX
	HMW%	Monomer%	LMW%	Acid%	Main%	Alkali%
D3	5.76	94.24	0	13.09	66.76	20.16
D6	4.58	95.42	0	12.41	67.86	19.71
D9	4.97	95.03	0	12.59	67.42	19.99
D12	5.05	94.95	0	12.65	68.11	19.24
D15	4.6	95.4	0	12.41	68.73	18.83
D17	4.74	95.26	0	11.8	68.46	19.75

（图4）CHO-K1 细胞EmCD CHO^® 906 灌流培养基中的抗体质量